ELISA的實驗結果計算

作為ELISA的最后一步，檢測結果的計算對整個實驗十分重要。

以夾心法為例。

1.ELISA的樣本通常要設置1~2個復孔進行檢測，分別求出標準品、實驗組樣本的吸光度的平均值。單個樣本的檢測值不應超出平均值的20%。

2.樣本的OD（吸光度）平均值要減去標準品濃度為0時的OD平均值。

3.建立標準曲線

在對數坐標圖上擬合四參數的邏輯函數曲線（X軸上為標準品濃度，Y軸為對應的OD值）。推薦使用ELISACALC軟件。

詳細步驟如下：

第一步: 輸入 OD 值和標準品濃度

此處選用的是百分率 logit 模型。

0輸入數據。這里中間的數據框中要輸入SO至S5的度與吸光值。注意，一定不能沒有SO。在左側“扣除本底”處可以輸入空白孔 (只加顯色液及終止液，) 的吸光值，如果沒有做，則就不用填了

第二步：“回/擬合模型”選擇“logit-log”方式。

第三步：點擊“回歸/擬合”顯示直線。

第四步：點“回歸方程”顯示參數，點“由Y計算 X”計算樣品與質控濃度。在空格中輸入樣品或質控的吸光值，回車或點擊“計算”。即能計算對應的濃度。

一般情況按照說明書推薦方法擬合標曲，可以用軟件繪制也可以手動制作。標曲呈現s型曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過與包被抗體結合的量，此時標準品已飽和，在增加標準品的量，其OD值不再變化，故當標準品達到一定濃度后，曲線趨于水平。按照科學分析方法，如果存在奇異點或者污點，直接采用線性分析不理想，要對擬合曲線的幾個點進行取舍，同時可以改用雙對數直線擬合或者四參數曲線擬合。

此處選用的是“Logistic 曲線擬合2(四參數模型）

1)輸入數據。這里中間的數據框中要輸入標準品STAA至STAF的度(后面測出的結果的單位和此標準品單位一致)與吸光值。在左側“扣除本底”處可以輸入空白孔(只加顯色液及終止液，)的吸光值，如果沒有做，則就不用填了

2）“回/擬合模型”選擇“Logistic 曲線擬合2(四參數)”方式

3)點擊“回歸/擬合”顯示標準曲線

4)點“回歸方程”顯示參數(內容可以直接復制)

5)點“由Y計算X”計算樣品濃度。在空格中輸入樣品的吸光值，回車或點擊“計算”即能計算對應的濃度。(技巧:可以在表格中復制所有樣品的Y 值，在軟件中點擊“粘貼”按鈕，就可以得出所有的 X 值哦!全部計算完可以點擊“復制”按鈕將結果復制下來，粘貼到 EXCEL 表格里面)另:若數值超出曲線范圍，則有可能得不到結果，如下圖0.468的Y值所示。

切記，在實驗過程中，要根據各個實驗本身的特點，選擇最適合的曲線擬合模型，才能得到最合理的實驗結果，一般情況下，需要綜合考慮標準曲線的趨勢走向以及R值的大小，來最終選擇適合自己的回歸方程。